CONSEJOS PARA LA REALIZACION DE UNA BUENA TECNICA DE AISLAMIENTO Y MONTAJE DE AORTA DE RATA WISTAR

Los estudios en órgano aislado se consideran como una técnica útil para evaluar los efectos de fármacos y extractos derivados de plantas en el músculo liso. Sin embargo, la técnica de órgano aislado vascular presenta como desventaja la dificultad de mantener el tejido viable para los ensayos farmacológicos. Esto se debe a la excesiva manipulación quirúrgica del tejido, a la hipoxia tisular por burbujeo inconstante del gas carbógeno y a concentraciones inapropiadas de electrólitos en la solución de Krebs asi como a otros factores. Además, con el transcurrir de los minutos el músculo liso vascular puede presentar fatiga y disminución de la tensión máxima, y ocasionar un factor de confusión cuando se toma como control la primera curva para el agonista. Otro factor que ocasiona dificultades para ejecutar la técnica, es la desensibilización de los receptores ocasionada al administar agonistas, fenómeno que ocurre por la fosforilación del receptor o recaptura de éste al citoplasma en un proceso mediado por beta-arrestina y clatrina.
El creciente uso de esta técnica por la comunidad científica internacional se debe a que es poco costosa, pues requiere menos animales en comparación con los modelos in vivo y permite evaluar en poco tiempo la actividad farmacológica de una gran variedad de extractos y moléculas de origen vegetal.
Es por esto que considere importante recabar información acerca de las caracteristicas que debe tener la técnica extracción y montaje de anillos de aorta de ratas wistar, ya que esta técnica tendrá una repercusión importante en las conclusiones de cualquier investigación en la que este modelo se utilice.
METODOLOGIA GENERAL
Se colocan anillos de aorta de rata en un equipo de baño de órganos (BIOPAC®) a una temperatura de 37oC y burbujeo constante de gas carbógeno. Los cambios en la tensión se registraron con un transductor de tensión isométrica y un equipo de adquisición de datos.
En la estandarización, se realizan curvas de concentración-tensión con fenilefrina a las horas 1, 3 y 5, para determinar la tensión máxima (TM) y la concentración efectiva 50 (EC50).

LA EXTRACCION

Se anestesian para extraer la aorta torácica por toracotomía. La arteria se coloca en una caja de petri con solución de Krebs-Henseleit (119 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 25 mM NaHCO3 y 5.6 mM glucosa) a 4o C más suplemento continuo de carbógeno (CO2: 5% - O2: 95%). Dentro de la solución se secciona en forma cuidadosa la aorta con un bisturí para obtener tres anillos concéntricos de 5 mm cada uno, aproximadamente; además si la tecnica lo requiere el endotelio se removera con un tubo PE-100 de polietileno.

MONTAJE

Para el montaje, cada anillo vascular se fija en sus extremos opuestos con dos alambres de plata y se coloca en un baño de órganos [Tissue Bath Station, BIOPACTM] con solución de Krebs-Henseleit (20 ml) a 37o C más suplemento continuo de carbógeno.

Uno de los alambres se fija al baño de órganos y el otro a un transductor isométrico de 50 g [TSD125, BIOPACTM] conectado a un equipo de adquisición de datos [MP-100, BIOPACTM] y éste al computador. La tensión basal aplicada a los anillos vasculares fue de 1 g. Los resultados de la tensión del músculo liso vascular y los efectos de los medicamentos se observaran en tiempo real con el uso de Acknowledge software v. 3.07 para Windows XP®. Todos los resultados se almacenaran en formato electrónico para posteriores análisis.

EFECTO DEL TIEMPO DE LA EXPERIMENTACION UNA VEZ MONTADO EL ANILLO

Se han desarrollado experimentos en los que en la reproducción del modelo de órgano aislado vascular no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la tensión máxima por fenilefrina de la primera, tercera y quinta horas. Sin embargo, a la séptima hora no se obtuvo respuesta contráctil con fenilefrina, por lo que los experimentos en órgano aislado vascular sólo se deben realizar por un máximo de cinco horas.

METODOLOGIA PARA DETERMINAR EL EFECTO DEL TIEMPO

Una vez acoplado el anillo vascular en el baño de órganos, se estimulara la respuesta tisular y se realizara la estabilización del tejido durante la primera hora de experimentación.
En algunos casos se ha realizado con solucion de krebs unicamente, en otros KCl (25 mM) cada 20 minutos y cambiando continuamente la solución de Krebs-Henseleit. Transcurrida la primera hora y una vez alcanzada la estabilización del tejido, se hace una curva de concentración vs tensión con fenilefrina añadida al baño de órganos de manera acumulativa (10 nM a 100 mM). Luego de obtener la tensión máxima (TM) con fenilefrina, se adiciona acetilcolina (10 mM) para comprobar la no viabilidad o viabilidad del endotelio. La curva con fenilefrina se repitie a la tercera, quinta y séptima horas en seis anillos vasculares para determinar los cambios temporales de la tensión máxima del músculo liso vascular in vitro y la desensibilización de los receptores alfa 1 a la fenilefrina.

INFLUENCIA DE LA EDAD DE LA RATA

En una reciente investigación sobre preparaciones aisladas de cilindros de aorta de ratas de 10-12, 20-22 y > 40 semanas de edad. Se evaluó la respuesta contracción/relajación inducida por adrenalina, acetilcolina y nitrito de potasio en presencia y ausencia mecánica o funcional de endotelio y en ausencia y presencia de L-arginina como facilitador de la síntesis de ON. La edad disminuyóen forma progresiva la capacidad del endotelio para producir ON y la respuesta vasodilatadora inducida por acetilcolina, incrementando la respuesta contráctil inducida por noradrenalina sin modificar la respuesta vasodilatadora inducida por nitrito de potasio. El endotelio favoreció la respuesta vasodilatadora,mientras que su ausencia mecánica o funcional potencióla respuesta contráctil. Esto nos lleva a la importancia de elegir un buen rango de edades en nuestros animales de experimentacion.