CONSEJOS PARA LA REALIZACION DE UNA BUENA TECNICA DE AISLAMIENTO Y MONTAJE DE AORTA DE RATA WISTAR

Los estudios en órgano aislado se consideran como una técnica útil para evaluar los efectos de fármacos y extractos derivados de plantas en el músculo liso. Sin embargo, la técnica de órgano aislado vascular presenta como desventaja la dificultad de mantener el tejido viable para los ensayos farmacológicos. Esto se debe a la excesiva manipulación quirúrgica del tejido, a la hipoxia tisular por burbujeo inconstante del gas carbógeno y a concentraciones inapropiadas de electrólitos en la solución de Krebs asi como a otros factores. Además, con el transcurrir de los minutos el músculo liso vascular puede presentar fatiga y disminución de la tensión máxima, y ocasionar un factor de confusión cuando se toma como control la primera curva para el agonista. Otro factor que ocasiona dificultades para ejecutar la técnica, es la desensibilización de los receptores ocasionada al administar agonistas, fenómeno que ocurre por la fosforilación del receptor o recaptura de éste al citoplasma en un proceso mediado por beta-arrestina y clatrina.
El creciente uso de esta técnica por la comunidad científica internacional se debe a que es poco costosa, pues requiere menos animales en comparación con los modelos in vivo y permite evaluar en poco tiempo la actividad farmacológica de una gran variedad de extractos y moléculas de origen vegetal.
Es por esto que considere importante recabar información acerca de las caracteristicas que debe tener la técnica extracción y montaje de anillos de aorta de ratas wistar, ya que esta técnica tendrá una repercusión importante en las conclusiones de cualquier investigación en la que este modelo se utilice.
METODOLOGIA GENERAL
Se colocan anillos de aorta de rata en un equipo de baño de órganos (BIOPAC®) a una temperatura de 37oC y burbujeo constante de gas carbógeno. Los cambios en la tensión se registraron con un transductor de tensión isométrica y un equipo de adquisición de datos.
En la estandarización, se realizan curvas de concentración-tensión con fenilefrina a las horas 1, 3 y 5, para determinar la tensión máxima (TM) y la concentración efectiva 50 (EC50).

LA EXTRACCION

Se anestesian para extraer la aorta torácica por toracotomía. La arteria se coloca en una caja de petri con solución de Krebs-Henseleit (119 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 25 mM NaHCO3 y 5.6 mM glucosa) a 4o C más suplemento continuo de carbógeno (CO2: 5% - O2: 95%). Dentro de la solución se secciona en forma cuidadosa la aorta con un bisturí para obtener tres anillos concéntricos de 5 mm cada uno, aproximadamente; además si la tecnica lo requiere el endotelio se removera con un tubo PE-100 de polietileno.

MONTAJE

Para el montaje, cada anillo vascular se fija en sus extremos opuestos con dos alambres de plata y se coloca en un baño de órganos [Tissue Bath Station, BIOPACTM] con solución de Krebs-Henseleit (20 ml) a 37o C más suplemento continuo de carbógeno.

Uno de los alambres se fija al baño de órganos y el otro a un transductor isométrico de 50 g [TSD125, BIOPACTM] conectado a un equipo de adquisición de datos [MP-100, BIOPACTM] y éste al computador. La tensión basal aplicada a los anillos vasculares fue de 1 g. Los resultados de la tensión del músculo liso vascular y los efectos de los medicamentos se observaran en tiempo real con el uso de Acknowledge software v. 3.07 para Windows XP®. Todos los resultados se almacenaran en formato electrónico para posteriores análisis.

EFECTO DEL TIEMPO DE LA EXPERIMENTACION UNA VEZ MONTADO EL ANILLO

Se han desarrollado experimentos en los que en la reproducción del modelo de órgano aislado vascular no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la tensión máxima por fenilefrina de la primera, tercera y quinta horas. Sin embargo, a la séptima hora no se obtuvo respuesta contráctil con fenilefrina, por lo que los experimentos en órgano aislado vascular sólo se deben realizar por un máximo de cinco horas.

METODOLOGIA PARA DETERMINAR EL EFECTO DEL TIEMPO

Una vez acoplado el anillo vascular en el baño de órganos, se estimulara la respuesta tisular y se realizara la estabilización del tejido durante la primera hora de experimentación.
En algunos casos se ha realizado con solucion de krebs unicamente, en otros KCl (25 mM) cada 20 minutos y cambiando continuamente la solución de Krebs-Henseleit. Transcurrida la primera hora y una vez alcanzada la estabilización del tejido, se hace una curva de concentración vs tensión con fenilefrina añadida al baño de órganos de manera acumulativa (10 nM a 100 mM). Luego de obtener la tensión máxima (TM) con fenilefrina, se adiciona acetilcolina (10 mM) para comprobar la no viabilidad o viabilidad del endotelio. La curva con fenilefrina se repitie a la tercera, quinta y séptima horas en seis anillos vasculares para determinar los cambios temporales de la tensión máxima del músculo liso vascular in vitro y la desensibilización de los receptores alfa 1 a la fenilefrina.

INFLUENCIA DE LA EDAD DE LA RATA

En una reciente investigación sobre preparaciones aisladas de cilindros de aorta de ratas de 10-12, 20-22 y > 40 semanas de edad. Se evaluó la respuesta contracción/relajación inducida por adrenalina, acetilcolina y nitrito de potasio en presencia y ausencia mecánica o funcional de endotelio y en ausencia y presencia de L-arginina como facilitador de la síntesis de ON. La edad disminuyóen forma progresiva la capacidad del endotelio para producir ON y la respuesta vasodilatadora inducida por acetilcolina, incrementando la respuesta contráctil inducida por noradrenalina sin modificar la respuesta vasodilatadora inducida por nitrito de potasio. El endotelio favoreció la respuesta vasodilatadora,mientras que su ausencia mecánica o funcional potencióla respuesta contráctil. Esto nos lleva a la importancia de elegir un buen rango de edades en nuestros animales de experimentacion.

Función del IP3 en la Cascada de Señalización Celular.

Inositol trifosfato, inositol 1,4,5-trifosfato o trifosfoinositol (abreviado InsP3 o IP3), es un segundo mensajero de la transducción de señal celular.
Se produce, junto con el diacilglicerol, por hidrólisis catalizada mediante la fosfolipasa C del fosfatidilinositol 4,5-bifosfato(PIP2) , un fosfolípido de membrana. Su efecto en el entorno celular es la movilización del Ca2+, almacenado en orgánulos como el retículo endoplasmático.
Ademas tiene gran importancia como sustrato indispensable de una cinasa presente en las celulas receptoras de insulina y en las celulas cancerosas: la Pl3 kinasa

PAPEL EN LA MOVILIZACION DEL CALCIO

La fosfolipasa C es una enzima de la membrana celular, donde su sustrato, el PIP2, está presente y es capaz de hidrolizar al (PIP2) en dos moléculas segundo mensajero de gran importancia, que terminan alterando las respuestas celulares a la proliferación, diferenciación celular apoptosis, remodelaje del citoesqueleto, tráfico vesicular, canales iónicos, funciones endocrinas y neurotransmisión.
La fosfolipasa C cataliza la reacción química del 1-fosfatidil-1D-mio-inositol 4,5-bifosfato (PIP2) y agua: Los dos productos de la reacción son el inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y el diacilglicerol(DAG).

El IP3 es soluble y difunde a través del citoplasma e interactúa con receptores específicos IP3 del retículo endoplásmico, causando la liberación de calcio, elevando así las concentraciones de calcio intracelular.

PAPEL EN LA CASCADA DE SEÑALIZACION PROVENIENTE DEL RECEPTOR MUSCARINICO M1

En este receptor como en muchos otros el IP3 tiene un papel principalmente como segundo mensajero ya que sin su existencia seria imposible seguir con la traducción del mensaje iniciado por agonistas como la acetilcolina
M1 Es un de los receptores muscarínicos humanos para el neurotransmisor de acetilcolina que se localiza mediando los potenciales excitatorios postsinápticos (PEPS) en los ganglios nerviosos.
Es un receptor común en glándulas exocrinas y el sistema nervioso central.
Se encuentra asociado a proteínas Gde la clase Gq las cuales usan a las vias de señalización celular de la fosfolipasa C activada y, por ende, del inositol trifosfatoy la vía del calcio intracelular.
El resultado de la union a agonistas(acetilcolina, oxotremorina, carbacol y McNA343) sera un más lento potencial excitatorio postsináptico y una disminución en la conductancia del potasio (K+).
Esto a su vez nos dara lugar a los siguientes efectos:

Potenciales excitatorios postsinápticos en los ganglios simpáticos y parasimpáticos.
Secreción de glándulas salivales.
Secreción del jugo gástrico del estómago.
Puede tener funciones en el SNC relacionados con la memoria.
Broncoconstricción inducida por el nervio vago.

RELACION DEL IP3 Y EL RECEPTOR INSULINICO

El receptor insulinico es una glicoproteina transmembrana compleja consistente en 4 subunidades formando un heterotetrámero.
Cuando se activa por la insulina, la parte intracelular de una de las subunidades b actúa como tirosina-protein kinasa específica.
La insulina se une a la porción N-terminal de la subunidad a y al hacerlo ocasiona un cambio conformacional de la subunidad b, cambio que estimula la actividad la actividad kinasa del receptor.
La unión de la insulina a las subunidades a del receptor provoca un cambio conformacional de las subunidades beta, lo que induce la autofosforilización en 6 residuos de tirosina. La fosforilización de la subunidad beta induce la fosforilización de la proteína IRS-1 (insulin receptor substrate 1). Esta fosforilización induce la unión covalente de la IRS-1 con otras nuevas proteínas específicas que tienen en común un dominio-SH2. Una de estas proteinas es la fosfatitidilinositol 3-kinasa.
A través de un mecanismo, todavía no bien dilucidado, la PI3-Kinasa activa una proteina de membrana, la proteína transportadora de la glucosa que toma la glucosa del medio extracelular y la transporta al interior de la célula.
De esta forma, a través de complejos mecanismos todavía no muy bien dilucidados, la insulina interviene en:
· activación del transportador de glucosa.
· activación de factores mitogénicos y de crecimiento.
· síntesis de proteínas y lípidos.
· síntesis de glucógeno .
Por segunda ocasión notamos la importancia trascendental del Pl3 como sustrato de la PI3-KINASA.
Otros ejemplo donde encontramos al Ip3 es en la transformación celular y la aparición de cáncer, en que la fosfoinositol 3-quinasa contribuye significativamente.

Una alteración en la regulación de esta enzima y en la transducción de estas señales en células inmunes se ve en diversos trastornos y enfermedades, incluyendo la leucemia y algunos linfomas.

FARMACOLOGIA DE FENIL-DIHIDROPIRIDINAS

IMPORTANCIA EN EL TRATAMIENTO ANTIHIPERTENSIVO

Como afirma la Organización Mundial de la Salud, la incidencia de la hipertensión arterial es muy elevada y podría alcanzar, en algunos países, el 15-22% de la población adulta.
La hipertensión arterial ejerce una influencia importante en la calidad de vida. Es uno de los principales factores de riesgo:
· Cardiovascular (riesgo de arteriopatía coronaria y enfermedades cerebrovasculares).
· En la progresión de la disfunción renal.
Dado que la prevalencia de la hipertensión aumenta con la edad, se espera que la incidencia y la importancia de este proceso clínico aumenten aún más en los países occidentales, en paralelo con el incremento del promedio de la esperanza de vida.
El tratamiento farmacológico de la hipertensión arterial disminuye significativamente la incidencia de enfermedades cerebrovasculares y coronarias. Por ejemplo, se ha calculado que el aumento de la presión diastólica podía incrementar la mortalidad al cabo de dos años en un 8% con cifras entre 100 y 120 mm Hg, y en un 64% con valores superiores a 150 mm Hg.

FARMACOS USADOS EN EL TRATAMIENTO DE LA HIPERTENSION

Hay varias clases de medicamentos que resultan eficaces en el tratamiento de la hipertensión arterial. Aunque recientemente la Organización Mundial de la Salud ha subrayado que la elección de un fármaco determinado se debe basar en las características clínicas específicas del paciente concreto, los medicamentos de primera elección más utilizados son:

1 Diurieticos.
2 Beta-bloqueantes.
3 Antagonistas del calcio.
4 Inhibidores de la enzima convertidora

de la angiotensina.
5 Alfa-bloqueantes.

Entre estos grupos farmacológicos, los antagonistas del calcio constituyen sin duda una opción terapéutica importante para un tratamiento antihipertensivo eficaz. En efecto, los antagonistas del calcio son muy eficaces en todas las fases clínicas de la hipertensión arterial:
Hipertensión leve o moderada, hipertensión grave, hipertensión arterial complicada con lesiones de los órganos efectores y casos en que la hipertensión arterial se asocia con otras enfermedades concomitantes.

Al igual que otras clases de fármacos antihipertensivos, los antagonistas del calcio pueden inducir efectos adversos, como cefalea y edema maleolar, que a veces obligan a la suspensión del medicamento. La mayor limitación proviene de los efectos adversos intrínsecos que los antagonistas del calcio pueden inducir en el corazón por su acción cronotrópica e inotrópica negativa y por la posibilidad de taquicardia refleja.
En los últimos años, el propósito de la investigación farmacológica ha sido elaborar nuevas moléculas capaces de mantener una buena eficacia antihipertensiva sin efectos adversos.


EVOLUCION DE LAS FENIL-DIHIDROPIRIDINAS

Los antagonistas del calcio se introdujeron en clínica hace más de 30 años.
Desde la introducción de la nifedipina en 1975, se han descrito una gran cantidad de nuevos derivados de DHP, conocidos como de segunda y tercera generación.
La primera, con la nifedipina como prototipo; la segunda, con agentes como la nimodipina, que tenían mejores propiedades físico-químicas y farmacodinámicas; y la tercera generación, con representantes como la amlodipina, que además de una mejor farmacocinética uniría a su perfil farmacológico una serie de acciones pleiotrópicas potencialmente beneficiosas.

Algunas dihidropiridinas presentan acciones particularmente importantes en lechos vasculares especiales: La nimodipina tiene una acción notable en los vasos cerebrales, mientras que la nicardipina tienen preferencia por los vasos coronarios.
Para algunos agentes, ha habido reportes de posibles acciones adicionales, entre las cuales se encuentran la inhibición de la agregación de moléculas de LDL modificadas (efecto atero-protectivo), acciones antioxidantes, reversión de cambios de membrana inducidos por enriquecimiento de colesterol, aumento de la síntesis de óxido nítrico e inhibición de la agregación plaquetaria.
Estos efectos en general han sido reportados con relación a la amlodipina, la lacidipina y la lercanidipina.


METABOLISMO DE FENIL-DIHIDROPIRIDINAS

Tienen una muy buena absorción gastrointestinal, pero la biodisponibilidad por vía oral, puede reducirse sustancialmente por causa del efecto de primer paso hepático. Entre los agentes que son afectados de manera más importante por el primer paso hepático se encuentra la isradipina, mientras que la nifedipina y la nicardipina están relativamente libres de este efecto.
Tienen alta unión a proteínas plasmáticas, pero el volumen de distribución tiende a ser relativamente alto. Aunque hay cierta excreción renal, el metabolismo es la vía más importante de eliminación de estos fármacos.
La vida media de las fenildihidropiridinas más antiguos es relativamente corta y por eso para la nifedipina, se dispone de preparados de liberación prolongada.

Las dihidropiridinas causan vasodilatación particularmente notable, sobre todo si son las de acción más corta como la nifedipina. La vasodilatación genera una reducción importante de la presión arterial, a expensas de la producción de reflejos simpáticos que aumentan la actividad cardiaca (efectos cronotrópico e inotrópico positivos), que son compensados en gran medida por la acción directa de los agentes que poseen una acción cardíaca relevante, como las fenilalquilaminas y las benzotiazepinas.
Es por esto que la asociación de beta-bloqueantes y dihidropiridinas puede ser aconsejable en algunos casos.

REACCIONES ADVERSAS DE FENIL-DIHIDROPIRIDINAS

En general son muy bien tolerados y la terapia con los mismos no necesita ser descontinuada por reacciones adversas sino en 7 % de los pacientes tratados con dihidropiridinas.
Las dihidropiridinas se asocian frecuentemente a manifestaciones secundarias a su gran acción vasodilatadora, como taquicardia refleja, edemas, rubor y cefalea.
El grado de selectividad vascular varía considerablemente entre las DHP, por lo que actualmente se sigue trabajando en la búsqueda de nuevas modificaciones estructurales, con el objetivo de encontrar una mayor vasoselectividad para así evitar los efectos colaterales sobre el miocardio durante la terapia antihipertensiva a largo plazo.
Las DHP reducen las complicaciones en hipertensos y en la insuficiencia cardíaca congestiva, con la misma efectividad que compuestos inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, por lo que aún se siguen prescribiendo exitosamente y sobre todo las DHP de larga duración.

FARMACOLOGIA DE AMLODIPINA

Los antagonistas del calcio del tipo de las dihidropiridinas, como la nifedipina, se han utilizado para el tratamiento de la hipertensión arterial y la angina pectoris. La nifedipina se absorbe rápidamente luego de la administración oral, pero sufre una depuración hepática extensiva, lo cual obliga a administrar 3 tomas diarias. Las concentraciones plasmáticas de nifedipina aumentan y disminuyen rápidamente luego de cada dosis, lo cual produce efectos adversos tales como cefaleas, taquicardia y eritema facial. La vida media plasmática prolongada de la amlodipina y la lenta aparición de su efecto terapéutico, hacen que esta droga no presente los efectos secundarios asociados a otras dihidropiridinas.

PROPIEDADES FISICOQUIMICAS DE AMLODIPINA

La amlodipina, una nueva dihidropiridina, fue desarrollada para mantener las propiedades farmacológicas de la nifedipina pero mejorando las propiedades farmacocinéticas de la misma. La molécula de amlodipina no sufre la extensa oxidación hepática que causa la alta depuración de otras dihidropiridinas. El átomo de nitrógeno del anillo dihidropiridínico queda protegido de la oxidación por el impedimento estérico que significa la larga cadena lateral de la amlodipina. La droga no sufre un metabolismo de primer paso importante y, al ser fácilmente absorbida, se obtiene una alta biodisponibilidad. La amlodipina posee un puente de hidrógeno intramolecular que parece ser responsable del mayor volumen de distribución y la mayor vida media de esta droga respecto de sus análogos.

FARMACOLOGIA IN VITRO DE AMLODIPINA

Las propiedades fisicoquímicas de la amlodipina dan lugar a efectos farmacológicos interesantes, caracterizados por la aparición y la desaparición gradual de la acción terapéutica.La amlodipina inhibe las contracciones dependientes de calcio en la aorta de rata con el doble de potencia que la nifedipina, pero con un comienzo de acción mucho más lento (3 hs vs. 30 min). La velocidad con la cual la amlodipina alcanzó el efecto máximo fue dependiente de la dosis, lo cual es consistente con un proceso de primer orden.

FARMACOLOGIA IN VIVO DE AMLODIPINA

En experimentos realizados en perros, tanto la amlodipina como la nitrendipina administradas en bolo produjeron vasodilatación arterial, con una reducción dosis-dependiente de la resistencia vascular sistémica y coronaria, asociada a un aumento en el flujo sanguíneo coronario, la contractibilidad miocárdica, la frecuencia y el volumen minuto cardíacos. Las respuestas producidas por la amlodipina aparecieron en forma más gradual y tuvieron mayor duración que las producidas por la nitrendipina. En perros con hipertensión de origen renal, el efecto antihipertensivo de la amlodipina apareció en forma gradual, obteniéndose una reducción máxima de la presión sanguínea a las 8 horas posteriores a la dosis.

INTERACCION DE LA AMLODIPINA CON CANALES DE CALCIO TIPO L

El análisis cinético reveló que la aparición gradual del efecto funcional de la amlodipina ocurría con constantes de disociación 2 ó 3 órdenes de magnitud inferiores que los de las otras dihidropiridinas. Este efecto también puede ser el resultado de la carga positiva y la conformación espacial de la amlodipina, que hacen que la molécula se ubique dentro de las membranas celulares, reduciendo el acceso de las moléculas al sitio receptor. Los estudios de unión de radioligandos realizados por el autor mostraron que las tasas de asociación y disociación en músculo ventricular de perro son lentas pero que la molécula tiene alta afinidad por los receptores de dihidropiridinas. Otras investigaciones muestran que la amlodipina desplaza completamente al diltiazem en condiciones en las cuales la nitrendipina sólo lo desplaza en forma parcial. Estos resultados sugieren que la amlodipina puede interactuar tanto con los receptores de dihidropiridinas como con los de diltiazem.

FARMACOLOGIA DE NIFEDIPINA

En 1969 se demostró que un derivado del verapamilo, el galopamil y otros compuestos, como la nifedipina, bloquean el movimiento de calcio por el canal lento y, así, alteran la fase de meseta del potencial de acción cardiaco.
Actualmente la nifedipina es usada como antianginoso, antihipertensivo y supresor del trabajo de parto pretérmino.
La nifedipina es una dehidropiridina bloqueadora de los canales lentos del calcio. Inhibe el influjo transmembrana de los iones de calcio en el músculo cardíaco y en el músculo liso, en tanto la liberación del calcio desde los sitios de almacenamiento intracelular también participa en la contracción del músculo liso vascular, sobre todo en algunos lechos vasculares. Además, la entrada de calcio extracelular puede desencadenar la liberación de más calcio desde las reservas intracelulares.

Poseé mayores propiedades vasodilatadoras en las arterias coronarias y a nivel arterial periférico que el verapamilo y con mínimos efectos en la capacitancia venosa. No tiene, o tiene muy poco efecto depresor en el nodo sinoauricular o atrioventricular, es decir, casi no produce bradicardia. Elefecto antihipertensivo es provocado muy probablemente por la disminución de las resistencias periféricas. Como reflejo ante la antihipertensión puede haber incremento en la frecuencia cardiaca, incremento en el gasto cardiaco y retención hídrica. Proporciona alivio sintomático en el vasoespasmo de la enfermedad de Raynaud.

La nifedipina mejora la oxigenación miocárdica (mejorando abasto/demanda), por lo que es muy útil en el angor pectoris. La nifedipina, como otros calcio-antagonistas, produce vasodilatación cerebral. La perfusión cerebral y la presión intracraneana aumentan. La presión de perfusión cerebral disminuye (PPC = PAM - PIC).

EFECTOS ADVERSOS DE NIFEDIPINA

Potencia el efecto de los relajantes musculares despolarizantes y no despolarizantes; tiene efecto cardiodepresor aditivo con los agentes volátiles halogenados, y otros antihipertensivos como diuréticos, inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina y otros vasodilatadores; incrementa la toxicidad de la digoxina, benzodiazepinas, carbamazepina, hipoglicemiantes orales y, posiblemente, quinidina y teofilina; administración adjunta con beta-bloqueadores puede producir insuficiencia cardiaca, bloqueos de conducción aurículoventricular, hipotensión y bradicardia severas. Con bupivacaína puede presentarse bradicardia e hipotensión arterial. Paro cardiaco si se administra con verapamilo o dantroleno endovenosos. Disminuye el efecto del litio; disminuye el aclaramiento renal de la cimetidina; químicamente incompatible con soluciones como bicarbonato de sodio y nafcilina; la molécula de nifedipina puede ser desplazada de sus sitios de acción por otras moléculas como anticoagulantes orales, difenilhidantoína, salicilatos, sulfonamidas y sulfonilureas.

Debe monitorizarse la presión arterial después de la administración de nifedipino; usarse con mucho cuidado en pacientes ancianos, hipovolémicos, en aquellos con infarto miocárdico agudo, angina inestable, depresión miocárdica severa o en presión intracraneana aumentada. Las tabletas de nifedipino de duración prolongada no deben dividirse ni masticarse.